【论文精选】长筒石蒜花青素合成酶基因LlANS的克隆与表达分析
《河南农业大学学报》2018年第52卷第4期刊载了南京林业大学风景园林学院风景园林江苏省重点实验室的王晰，丁文杰，李娅，刘家伟，王良桂和岳远征的论文——“长筒石蒜花青素合成酶基因LlANS的克隆与表达分析”。该研究由国家自然科学基金项目(31601785)，江苏高校品牌专业建设工程资助项目（PPZY2015A063）和南京林业大学科技创新基金项目(CX2016002)资助。责任编辑曾庆东。
长筒石蒜为单子叶植物纲石蒜科石蒜属植物，为中国特有种，是应用前景较好的园林植物。目前，花色改良和新品种培育是提高花卉观赏性状的有效手段，未见利用基因工程对该属植物进行花色育种的成功报道，这在很大程度上影响了石蒜属植物的推广应用。花青素属于类黄酮物质，是花表皮组织主要显色物质。花青素合成酶ANS是植物花青素生物合成途径末端的一个关键酶。目前，关于石蒜属植物中ANS基因的报道仍较少。
本研究以石蒜属种内花色变异最为丰富的长筒石蒜为材料，选用粉色系长筒石蒜花瓣为材料，结合作者已获得的长筒石蒜花瓣转录组数据，利用PCR技术从长筒石蒜中克隆获得了LlANS基因的全长编码区序列，并分析该基因编码蛋白的特征、亚细胞定位情况及其在长筒石蒜粉色花花瓣中不同发育时期的表达模式，为进一步解析长筒石蒜花青素苷生物合成途径的调控机理以及为石蒜属植物花色改良奠定基础。
长筒石蒜来源于南京林业大学园林植物学科石蒜种质资源库，于2016年8月选取粉色系长筒石蒜植株的3个不同发育时期(初蕾期、中蕾期，盛花期)花朵的花瓣。采用植物总RNA提取试剂盒提取长筒石蒜花瓣的总RNA。根据前期作者已获得的长筒石蒜花瓣转录组数据库，筛选得到1个与ANS 蛋白同源性较高的Unigene片段，设计1对特异性引物对其编码区序列进行克隆。
使用ORF Finder在线软件预测LlANS基因的开放阅读框和编码的蛋白质序列，用SMART等在线工具推导出蛋白质相关理化性质，并预测蛋白的跨膜区和信号肽，使用NJ邻接法构建系统进化树。设计含有酶切位点（Sal I和Kpn I）的引物，在激光共聚焦显微镜下观察细胞内产生荧光的位置，确定长筒石蒜ANS蛋白的亚细胞定位情况。
根据LlANS的cDNA全长序列在非保守区设计荧光定量引物，以粉色长筒石蒜花瓣3个发育阶段的cDNA为模板，选取长筒石蒜eIF基因作为内参基因进行LlANS基因的表达分析，进行基因的实时定量。
结果表明，该基因开放阅读框全长为1 068 bp，编码355个氨基酸，蛋白质分子量约为40.08 kD，理论等电点为5.58，属于酸性不稳定的亲水性蛋白；LlANS蛋白属于α-酮戊二酸依赖性双加酶家族，具有典型的花青素合成酶ANS蛋白功能结构域2OG-Fell-Oxy；系统进化树分析表明该基因与同属的石蒜和中国石蒜中ANS基因具有较高同源性，最高达97 %；亚细胞定位观察显示LlANS蛋白定位于细胞核、细胞质及细胞膜中。
此外，实时荧光定量分析证实LlANS基因在长筒石蒜粉色花花蕾期表达量较低，在盛花期的表达量最高。以上结论表明，LlANS作为长筒石蒜花色苷合成途径中的一个关键节点基因，可能对于长筒石蒜粉色花花色的形成起着极为重要的作用。
通信作者：
岳远征，南京林业大学风景园林学院园林植物系副教授，博士，研究生导师。主要从事园林植物遗传育种与生物技术、园林植物造景与应用研究。先后参加国家级及学校科研项目五项，国际杂志Scientific Reports审稿人，发表国内外论文十余篇。
免费论文全文阅读
河南农业大学学报
∣做有思维的学术媒体∣
版权声明：
本文为《河南农业大学学报》编辑部原创内容，欢迎转载，请联系授权！
本文所使用图片均出于非商业性的教育和科研目的，如涉及版权等问题，请立即联系我们，我们会予以更改或删除，保证您的权益。
联系方式：
责任编辑 ∣ 曾庆东
联系电话 ∣ 0371-63558885
联系邮箱 ∣ hnndxb@henau.edu.cn